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探索生物催化关键科学问题 推动高附加值化学品高效绿色合成——华南理工大学食品科学与工程学院副院长娄文勇教授
2019-08-02
娄文勇，教授，华南理工大学食品科学与工程学院副院长，国家优秀青年科学基金（首届国家优青）获得者，国家新世纪优秀人才，轻工技术与工程学科评估专家，广东省高等学校“千百十工程”国家培养对象，广东省特支计划“百千万工程领军人才”；兼任广东省青年科学家协会理事，广东省高新技术企业评审专家。曾荣获广东省自然科学奖二等奖、“十一五”轻工业联合会科技创新先进个人奖，2017年带领团队荣获“第十三届国际遗传工程机器设计大赛（IGEM）”金奖并提名为最佳新应用项目，2018年度中国石油和化学工业联合会青年科技突出贡献奖获得者。现为多个国际学术期刊的兼职审稿人。
娄文勇教授一直从事生物催化过程调控及应用基础研究，在新型非水介质强化生物催化合成高附加值精细化合物、酶的新型纳米固定化技术、新型高效生物催化剂的挖掘与改造等方面取得一系列有影响的科研成果。先后主持国家自然科学基金4项（面上项目）、广东省自然科学基金重点项目1项，作为第二负责人参与国家自然科学基金重点项目1项。在期刊上发表SCI论文120余篇，获授权发明专利15件（含催化活性基团和吸附基团的固体酸催化剂及其制备与应用， ZL201210560833.4；一株产甲壳素酶菌株及其利用蟹壳发酵产甲壳素酶的应用， ZL201410635361.3等），出版专著2部，参编英文专著2部。
1 新型非水介质强化生物催化性能的机制研究
娄文勇教授系统研究了离子液体和深度共熔溶剂对生物酶和微生物细胞催化合成精细化合物的影响，阐明了新型非水介质强化生物催化性能的机制。其中，研究离子液体对生物酶（环氧化物水解酶、脂肪酶、木瓜蛋白酶及青霉素酰化酶等）合成一系列功能手性化合物过程的影响规律，发现反应体系中存在适量的离子液体能很好地维持酶分子的活性构象，提高酶与底物的亲和性，稳定底物-酶的过渡态，降低反应的活化能，增强酶分子结构的“刚性”。与此同时，离子液体对酶的不对称水解的影响不仅取决于离子液体的种类，还因离子液体的浓度、酶、底物的不同而异，展示了离子液体对酶催化特性影响的多样性。发现酶在含较弱氢键碱度、亲核性阴离子的离子液体介质中表现出较高的活性、对映体选择性及稳定性；酶的对映体选择性和稳定性均随离子液体的疏水性增大而提高；用光谱分析法进一步探讨含不同离子液体介质中木瓜蛋白酶分子构象的变化，证实离子液体对木瓜蛋白酶分子结构的影响显著。离子液体在强化微生物细胞催化方面，研究含离子液体中不同微生物细胞催化潜手性酮不对称还原反应特性，揭示了传统离子液体的阴、阳离子特性和新型离子液体深度共熔溶剂的氢键供体和受体种类对细胞催化还原反应的影响规律，特定阴阳离子和氢键供体和受体的匹配对细胞发挥最佳催化效果至关重要。在亲水性离子液体中，离子液体的添加能很好地溶解底物和产物，适度提高细胞膜的渗透性，降低底物和产物对细胞的毒性，显著提高细胞的活性、稳定性及所催化反应的选择性，建立起高效、高选择性制备对映体纯手性醇的生物催化体系。借助荧光成像显微镜检测分析，发现离子液体也可进入细胞内，与胞内相关酶发生相互作用。此外，研究疏水性离子液体对微生物细胞催化还原反应的影响规律，发现一些生物相容性好的离子液体能有效地解除底物或产物对细胞的毒性及抑制作用，且能在线分离产物，具有很好的应用潜力。
2 酶的新型纳米固定化技术的研究
具有高度生物相容性的大分子纤维素纳米晶是理想的固定化酶载体材料之一，娄文勇教授利用原位共沉淀-静电自组装和原位共沉淀-交联两种方法，制备出两种均一稳定的磁性纤维素纳米晶材料MNCC，并探索了其分子形成机理。基于上述方法的简便性和高效性，进一步将其拓展到磁性纳米颗粒固定化酶的体系中，实现了木瓜蛋白酶、脂肪酶、青霉素酰化酶、碱性蛋白酶等酶分子的固定，显著提升了天然酶对温度、pH、有机溶剂等不利因素的耐受性。上述固定化酶体系在二肽类化合物、酮基布洛芬、头孢克洛、燕麦多肽、二氢杨梅素乙酸酯等一系列高附加值精细化合物的生产中表现出了显著高于天然酶的催化性能。其中发明专利“一种燕麦水解蛋白的工业化生产方法”（专利号：ZL201410005750.8）已在广州环亚集团实现成功转化，产生一定的经济效益。
基于上述方法的普适性，构建了刚性金属有机骨架材料固定化酶体系中。利用原位共沉淀-交联方法，构建了MOFs包埋的葡萄糖氧化酶固定化体系，利用MOF的多孔性促进酶催化过程中的物质传递，GOx的催化活性完全保留；此外，刚性的金属有机骨架屏蔽了外界不利因子，GOx-MOFs复合物在有机相存在条件下，活性显著高于天然酶，为进一步提高MOFs体系的生物相容性，拓展其应用范围，娄文勇教授创新性提出采用生物相容性良好的氨基酸替代有机配体，制备出具有良好生物相容性的MOF材料（BioMOF）并将其应用于酶的固定化，在催环辛烯的氧化反应速率提高至天然酶的1.5倍，对过氧化物、高温和有机溶剂的耐受性均得到增强。
3 新型高效生物催化剂的挖掘与改造
工业微生物产业是现代生物经济发展的坚定基石，而微生物催化的化学反应由酶驱动。基于此，娄文勇教授采用导向筛选和基因挖掘相结合的策略，获得生物催化制备医药、农用化学品和天然产品等所需的酶，包括羰基还原酶、甲壳素酶、脂肪酶、甲酰胺酶、亚磷酸脱氢酶、环氧化物水解酶、肌醇加氧酶、醛酸脱氢酶、葡萄糖六磷酸异构酶等，丰富了微生物催化元件的多样性。
来源于醋酸杆菌的羰基还原酶可广泛地应用于手性药物、农药、香精香料及液晶材料的制备。针对天然羰基还原酶活力不够理想以及辅酶循环再生能力差等问题，在“发现-理解-改造”的范式研究基础上，对该酶的结构-功能关系进行了解析，并采用半理性策略对其活性及底物耐受性进行设计，获得三种活性显著提高的突变体，该突变体对11种结构多样性的羰基底物的催化活性均得到显著的提高（提升17～61倍），并构建了完整的辅酶循环系统，提升了催化反应效率。此外，来源于类芽孢杆菌的甲壳素酶能高效地分解甲壳素成为高附加值的N-乙酰甲壳二糖。针对天然甲壳素酶热稳定性较差的问题，对其热稳定性进行改造，获得的突变体S244C-I319C-T259P在50 ℃条件下的半衰期提高了169倍，活力提高2倍，表明脯氨酸可降低该酶的结构柔性，同时对其活力也有影响。结合甲壳素酶、甲壳素脱乙酰酶和N-乙酰葡萄糖胺酶，实现甲壳素直接生成具有生物活性的氨基葡萄糖，提高了甲壳素的附加值。此外，为合成广泛应用于食品、化工和医药领域的高附加值葡萄糖二酸，娄文勇教授通过无细胞代谢工程手段，从头设计了全新的萄糖二酸人工合成途径，并经过催化元件募集及适配性考察后在体外通过多酶级联反应完成，为葡萄二酸的合成提供了一种高效快捷、环境友好的合成方法。
在大肠杆菌工程菌的发酵应用中，染菌和噬菌体侵染一直是发酵企业特别关注和难以避免的问题。基于此，通过基因工程手段改造大肠杆菌的鲁棒性，获得了加强型大肠杆菌工程菌。通过调节发酵培养基的营养成分，限制培养基的氮源和磷源可以有效的控制杂菌的污染；此外，引入CRISPR/Cas系统赋予其抵抗相应噬菌体的能力。结果表明具备该系统的工程菌甚至可在开放环境下进行操作，而且普适性强（可在酿酒酵母和枯草芽孢杆菌等底盘细胞中稳定运行），并能高效的合成外源蛋白。鉴于该项目研究成果，获得2017年国际遗传工程机器大赛（iGEM）金奖（指导老师），并且该项目被提名为“最佳新应用项目”。
