揭示病毒致病机理　探索全新治疗方案——湖北工业大学中德生物医学中心

2018-08-09

湖北工业大学中德生物医学中心（以下简称“中心”）在胡康洪博士的带领下，组建了由德国杜赛尔多夫大学Detlev Riesner教授、德国弗莱堡大学医院Michael Nassal教授、军事医学科学院吴祖泽院士、武汉大学中南医院肝胆疾病研究院院长叶啟发教授等国内外知名学者为学术顾问的研究团队，对慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染、肝纤维化和致癌机理的分子生物学进行研究。围绕病毒RNA结构与功能关系在复制中的意义开展调查，为寻找新颖的药物靶标提供理论依据。利用基因封闭技术，为慢性乙型肝炎提供治疗策略，涉及的方法有：反义寡核苷酸、反义RNA、小分子RNA干扰技术、核酶技术、诱饵技术、基因编辑等。此外，将三维细胞培养技术运用到生物医学研究中。聚脂羊毛作为“人工脉管”代替生长支架，采用完全不含血清的DMEM化学培养基培植干细胞，建立了完全可控制生长环境的三维培养技术。人工脉管模拟体内环境，由细小的纤维、间隙和孔洞组成，氧气、激素和营养成分得以通过，而废物可以从里面过滤出来。所创建的这种灌流式三维细胞培养技术，广泛应用于组织再生、药物筛选和干细胞定向分化。

近年来，该中心在病毒学和再生医学方面取得了一系列成果。

一、发现KNK437在转录水平上抑制乙型肝炎病毒复制

HBV在肝细胞内复制过程中，病毒反转录酶（P蛋白）与前基因组RNA（Pregenomic RNA，pgRNA）上的RNA包装信号ε形成P-ε复合物，启动反转录合成和核衣壳装配。封闭P-ε相互作用是一种极具吸引力的抗HBV策略。已知P-ε形成RNP复合物正常发挥活性时，需要热休克蛋白（Heat-shock proteins，Hsps）参与。对此，中心探索了Hsps抑制剂N-甲酰基-3,4-亚甲二氧基苄基-γ-丁内酯（KNK437）对HBV复制及转录的影响。

采用HepG2.2.15细胞系和瞬时转染携带HBV全基因组的质粒的Huh7细胞系作为模型进行研究。实验结果发现：20微摩尔 KNK437对细胞没有毒性，在该浓度下KNK437除HepG2.2.15模型外，均下调HBV S表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）向胞外分泌，抑制细胞内HBV核衣壳中DNA合成，降低细胞内HBV RNA转录水平，最低可使DNA水平降至1.5%左右，RNA水平降至30%左右，从而表明KNK437抑制HBV复制和转录。在HepG2.2.15中的免疫印迹试验显示，KNK437明显减少细胞内衣壳亚单位（core）表达水平。KNK437也抑制Hsp70、Hsp90b、Hsp40等3种热休克蛋白RNA的转录，从而验证了KNK437的确是一种泛Hsps抑制剂。结果显示，KNK437具有潜在抗HBV应用前景。

二、肠道病毒71型（EV71）3C蛋白酶表达纯化、活性分析及与抑制剂模拟对接研究

肠道病毒71型（简称EV71），属小核糖核酸病毒，是导致婴幼儿手足口病的主要病原体之一。EV71感染还可导致儿童病毒性脑膜炎、心肌炎、肺水肿等并发症，病死率高。近20年来，EV71在亚太地区频繁暴发，被认为是危害婴幼儿健康的重大公共卫生问题。目前临床使用的治疗手段是广谱抗病毒药物，特异性靶向EV71的药物鲜有报道，因此开展抗EV71药物的研究势在必行。EV71 3C蛋白酶在病毒复制过程中发挥关键性作用，这使其成为药物开发极具吸引力的靶标。3C蛋白酶是由183个氨基酸组成有催化活性的EV71功能蛋白，能催化EV71前体多聚蛋白裂解为成熟的结构蛋白和非结构蛋白，降解宿主蛋白（如Poly A结合蛋白），干扰宿主mRNA合成；抑制3C蛋白酶活性可有效阻断EV71复制。研究将EV71 3C蛋白酶基因克隆至pET-28a载体，在BL21中诱导表达，并进行纯化，得到具有活性的3C蛋白酶。通过计算机模拟与抑制剂的结构对接研究及进一步实验验证，寻求特异抑制EV71  3C蛋白酶的活性成分，为EV71药物开发奠定基础。

三、EV71感染相关调控枢纽基因筛选

由于对EV71发病机制缺乏足够了解，抗EV71病毒药物研发缓慢。因此，研究EV71感染的发病机制在医学和生物学领域引起了研究者的广泛兴趣。病毒在感染期间，可以通过调节宿主细胞基因表达以增强其存活机会，这些活动包括改变细胞微环境，使病毒成功复制和逃避宿主免疫系统。阐明病毒用于建立感染的机制将使我们更好地理解EV71病毒的发病机理，有助于开发针对EV71感染的潜在抗病毒疗法。中心利用全基因组表达谱的比较分析（RNA-Seq技术）研究EV71与宿主细胞的特异性相互作用。收集感染EV71的宿主细胞RD的mRNA，与未感染的RD细胞相比，共鉴定了1.5万多个基因，筛选出329个差异表达基因（DEGs），包括199个上调基因和130个下调基因。GO和KEGG途径富集分析显示：大部分DEGs与转录调节、免疫应答和炎症反应、凋亡诱导因子有关，并且涉及JAK-STAT和MAPK信号传导途径。经过PCR验证，差异表达明显且稳定的关键基因被用来作进一步深入分析，阐明其在EV71感染中的调控机制。这些关键基因的发现及挖掘，可能为EV71感染机制的阐明和抗病毒药物靶标发现提供新线索。

四、再生医学领域开花结果，校企合作经济效益显著

此前的科学探索和实践均证明，干细胞中含有多种丰富的抗衰老生长因子。目前，通过常规二维培养，干细胞性状发生退化，细胞内生长因子水平急剧下降，难以实现工业化应用。经过多年创新研究，胡康洪博士团队原创研发出了独具特色的灌流式三维细胞培养系统，可以使干细胞在体外增殖并基本维持体内性状。培育干细胞提炼抗衰老成分，作为原料添加至化妆品中，工业化运用效果明显。目前，通过校企合作，企业年销售收入已达到3.5亿元人民币，经济效益明显。

机构简介

湖北工业大学中德生物医学中心从2013年初开始筹建，2014年3月正式启动运行。主要研究领域为病毒学和再生医学，探索传染性病原体如肝炎病毒、肠道病毒的复制机制和致病机理，寻找新颖的抗病毒靶标，发展有效的抗病毒药物用于临床治疗；该中心致力于拓展抗肿瘤药物的个性化治疗方案：以三维细胞培养技术为平台，诱导干细胞体外定向分化为各种功能性组织，替代因疾病损伤的组织或器官；大规模抽提和纯化干细胞中具有抗衰老活性的生长因子，投入工业化妆品运用。经过5年多的运行，该中心已打造为拥有完整产学研链条的国际合作示范基地。