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鳜传染性脾肾坏死病毒DNA疫苗开发及浸泡免疫关键技术研究

2017-11-15

近年来我国水产养殖中病毒性疾病造成的损失呈上升趋势,由于病毒性疾病大多缺乏具有针对性的治疗药物和手段,疫苗防控越来越受到水产养殖业的重视。目前大量使用的注射免疫方式使得水产疫苗的应用和推广受到了很大限制,开发使用成本低廉的DNA疫苗和简单的免疫方式对水产养殖业的发展尤为重要。大量研究表明,基于粘膜系统的疫苗能够提高病原体感染后实验动物的生存率。DNA疫苗不仅能够通过粘膜系统使鱼体产生足够的免疫保护力,同时还能够刺激机体非特异性免疫产生额外的免疫保护。

鳜鱼病毒病对我国的鳜养殖业造成很大危害,其主要病原是传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)。根据全国水产技术推广总站数据显示,2015年鳜鱼养殖规模较上年减少58%。目前,该病没有针对性强的特效药物,主要通过水质调节和免疫增强减缓病症,鳜鱼养殖业急需防治疫苗。由于鳜鱼是肉食性鱼类,性格暴躁,只吃活鱼,口服或注射的免疫方式很难在鳜鱼养殖中使用,因而疫苗浸泡免疫是鳜鱼免疫的唯一选择。ISKNV主要衣壳蛋白(major capside protein, Mcp)是病毒粒子的主要抗原蛋白,该研究克隆了ISKNV Mcp基因,构建了重组Mcp基因的DNA疫苗(pcMCP),并对鳜鱼苗进行浸泡免疫。研究表明,针对ISKNV引起的病毒性疾病,以ISKNV MCP基因构建DNA疫苗,通过浸泡免疫的方式对鳜鱼进行免疫,实施后血液中白细胞含量、白细胞吞噬能力和超氧化物歧化酶(SOD)都显著提高,IgM和Mx基因的mRNA在72小时大量表达。攻毒试验显示,pcMCP浸泡免疫降低了感染传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)鳜鱼的死亡率。

一、研究内容

(一)DNA疫苗浸泡免疫预防鳜传染性脾肾坏死病毒

以ISKNV MCP基因为目的基因构建成DNA疫苗pcMCP,对鳜鱼浸泡免疫效果表明,pcMCP DNA疫苗能够刺激免疫系统,对非特异性免疫和IgM的表达都具有激活作用。免疫后血液中白细胞含量、白细胞吞噬能力和SOD都显著提高,14天时均达到最大。IgM和Mx基因的mRNA表达研究显示,在72小时大量表达,96小时达到最大,分别是对照组的3.05倍和2.02倍。攻毒试验显示,浸泡免疫能够有效保护ISKNV感染的鳜鱼,在第11天,浸泡免疫组的累计死亡率仅为40%,而对照组死亡率都达到了100%,表明pcMCP浸泡免疫降低了感染传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)鳜鱼的死亡率。

(二)鳜传染性脾肾坏死病毒DNA疫苗与全病毒灭活疫苗浸泡免疫效果比较 

通过对鳜传染性脾肾坏死病毒DNA疫苗与全病毒灭活疫苗浸泡免疫后免疫系统的活化进行比较,确定鳜传染性脾肾坏死病毒DNA疫苗的免疫保护力。结果表明,DNA疫苗组在免疫后随时间推移,白细胞数目逐步升高,到21天后白细胞数目大于灭活疫苗组,浸泡免疫后血清中的抗氧化酶SOD酶活性都有所提高;在时间上,DNA疫苗较灭活疫苗活化时间晚,但作用时间长,28天时达到最大145U/mL。在激活抗病毒相关基因方面,IgM和Mx基因mRNA表达量在DNA疫苗浸泡免疫后随时间的推移逐步升高,表达时间较病毒灭活疫苗长。

在DNA疫苗和病毒灭活疫苗的比较研究中发现,DNA疫苗和灭活疫苗浸泡免疫在免疫应答的时间上具有互补性。具体讲,灭活疫苗浸泡免疫的免疫应答快,但单次免疫的持续性短,而DNA疫苗浸泡免疫的免疫应答晚,但免疫保护持续时间较长。

二、DNA疫苗浸泡免疫大塘实验

该项目中构建的针对鳜传染性脾肾坏死病毒的高特异性DNA疫苗,通过注射免疫研究明确了DNA疫苗的有效性。由于浸泡免疫研究的实验室阶段和疫苗应用的大塘阶段水环境差别较大,大塘水体中各种颗粒物、微生絮团大量存在,对极性的疫苗分子有较大的吸附和沉降作用。通过中和疫苗表面电荷极性确保在养殖水体中疫苗分子的有效浓度,从而确保了浸泡免疫效果。

通过开展鳜传染性脾肾坏死病毒DNA疫苗大塘实验,研究了鳜传染性脾肾坏死病毒DNA疫苗大塘试用的抗病毒效果。在鳜鱼苗下塘前,将疫苗加入活鱼运输车进行免疫,免疫时间确保大于30分钟;鱼苗下塘后与周边未免疫的鱼苗比较鳜鱼虹彩病毒的发病和用药情况。结果表明,DNA疫苗两次免疫后对鳜传染性脾肾坏死病毒病的预防总有效率为67.8%,免疫组的存活率在77.5%88.5%,渔民增收超过15%以上。

试验池(亩)

下塘鳜鱼总数(尾)

出塘鳜总数(尾)

成活率(%)

疫苗有效率(%)

4(对照池)

4000

2548

63.7

-

5

5000

4255

85.1

59

10

10000

8850

88.5

68.3

总有效率(%)

65.3

 

 

 

试验池4~6亩

下塘鳜鱼总数(尾)

出塘鳜总数(尾)

成活率(%)

疫苗有效率(%)

1对照

5500

3025

55

-

2

6000

4704

78.4

52.0

3

7500

6232

83.1

62.4

4

8500

6587

77.5

50.0

总有效率(%)

54.7

 

 

三、推广应用前景

我国水产养殖密度大,病害频发,药物的大量使用严重影响了水产品质量安全,给我国本已脆弱的水资源环境带来极大的压力。水产养殖用疫苗,尤其是DNA疫苗构建极为简便,生产成本低廉,生产工艺技术难度低,储蓄运输条件方便,为市场急需产品。该研究表明,DNA疫苗浸泡免疫能够有效刺激鳜鱼鱼体产生免疫保护,降低养殖过程中的养殖风险,减轻鳜鱼养殖病害,减少鳜鱼养殖中的药物投入和人力投入,增加渔民收入。特别是作为我国鳜传染性脾肾坏死病防治首例DNA浸泡免疫产品,如果能够在鱼苗出厂前或下塘前进行免疫浸泡,将会起到非常好的免疫效果,产品市场需求量巨大,应用前景十分广阔。

主要完成人简介

周伟东,1982年生,博士,高级工程师,武汉市农业科学院水产研究所副所长,鱼病与水环境研究室副主任。曾在国内外发表学术论文20余篇,其中SCI收录8篇,2013年获得湖北省成果推广三等奖。