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向“超级细菌”宣战

2017-10-13

世界卫生组织资料显示,全球每年死于抗生素耐药的约有70万人,抗生素滥用还会导致巨额经济损失。美国疾病控制与预防中心发布的《抗生素耐药威胁在美国,2013》指出,美国每年耐药菌感染至少200多万人,直接导致2.3万人死亡,每例耐药菌感染患者较敏感菌感染患者多支出38 121美元。我国有专家报道,每例耐药性金黄色葡萄球菌感染患者较敏感性金黄色葡萄球菌感染患者多支出63 959.5元,延长住院时间8.2天。

生物酶及多肽类物质因其能直接裂解细菌细胞壁的独特杀菌机制得到了越来越多的重视,并被用于解决微生物耐药性问题。基于这一思路,上海高科生物工程有限公司开展了生物酶和抗菌肽的研发与产业化应用,自1993年起,历经20多年努力,取得了诸多创新成果。

一、主要研究内容和成果

(一)建立了生物抗菌酶和抗菌肽数据库,为创新型药物的设计开发奠定了基础

EnzyBase酶类抗菌蛋白数据库:共收集了1 144种酶类抗菌蛋白,包含噬菌体裂解酶,细菌素和溶菌酶。

GMEnzy抗生酶遗传改造数据库:共收集了186种进行了遗传改造的抗生酶,其中进行结构域重排改造的有34个,截断改造的有89个,突变改造的有61个,融合多肽改造的有2个。

LAMP抗菌肽数据库:共收集了5 547种抗菌肽,包括3 904种自然来源和1 643种合成抗菌肽。

(二)溶葡萄球菌酶的研究

溶葡萄球菌酶是1964年Schindler和Schudardt首先从Staphylococus Simulans(NRRLB—2628)株的培养物中发现,后来,经过大量科学家的研究证明了溶葡萄球菌酶(Lysostaphin )是一种肽链内切酶,可切断MRSA等细菌细胞壁肽聚糖键五甘氨酸肽键桥,迅速杀死细菌,作用机理不同于现有抗生素,并且不易产生细菌耐药性。

上海高科生物工程有限公司的研究团队成功解决了溶葡萄球菌酶产业化的一系列技术壁垒,构建了溶葡萄球菌酶大肠杆菌外分泌系统、完成发酵和纯化工艺研究,完成了生物消毒剂、医疗器械等产品的配方研制,完成药效学、药代动力学研究和安全性研究等,实现了产品的成功上市。

1.经过20多年的研究,溶葡萄球菌酶的研究处于国际领先水平,相关技术申请了全面的知识产权保护

申请的发明专利涵盖了该酶的基因克隆表达、生产工艺和下游产品的开发,获国家发明专利“一种溶葡萄球菌酶复配制剂及其制备方法”(ZL03103476.4)、“一种足部消毒剂”(ZL200310107984.5)等30项,核心技术A Method of Secretory Expression of lysostaphin in Escherichia Coli at High level已经获得5项外国发明专利的授权,分别为美国(US8241901)、欧洲(EP1918369)、新加坡(SG139287)、韩国(KR2008-7001751)、日本(JP5242388),占目前国际上授权的溶葡萄球菌酶相关专利的近40%。

2.溶葡萄球菌酶一类新药的研究

烧伤感染是烧伤患者死亡的主要原因,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染因其耐药严重,对患者危害巨大,是控制烧伤感染的一个难题。

研究团队针对烧伤MRSA感染开发了一类新药外用重组溶葡萄球菌酶。完成了重组溶葡萄球菌酶的全部临床前实验研究,如目的基因克隆与表达研究、发酵生产工艺研究、产品纯化工艺研究、制剂处方筛选与生产工艺研究、质量及产品标准研究、长期稳定性研究、主要药效学研究、非临床药代动力学研究、一般安全性药理研究、急性毒性与长期毒性研究、生殖毒性研究、免疫毒性研究、三致试验研究等,并于2005年11月14日获得国家第1类生物制品临床试验批文(临床批件号:2005L03961)。

3.溶葡萄球菌酶兽用抗感染药物的研制

奶牛乳房炎和子宫内膜炎是奶牛业两个最主要疾病。我国奶牛子宫内膜炎的发病率为10%30%,乳房炎的发病率更高,隐性乳房炎阳性率高达70%以上。目前在这两大疾病的治疗上主要采用抗生素,随着抗生素的广泛和大量使用,细菌耐药性问题更加严重,导致这些疾病的治愈率低下,奶制品中抗生素残留超标。猪养殖领域抗生素滥用更加普遍和严重,一方面是受经济利益驱使大量使用抗生素促生长剂,另一方面是超量超范围不合理使用抗生素治疗疾病导致细菌耐药。

研究团队成功开发了治疗奶牛子宫内膜炎和乳房炎的国家一类新兽药重组溶葡萄球菌酶粉[(2009)新兽药证字29号]。该产品对奶牛子宫内膜炎和乳房炎的疗效显著,溶葡萄球菌酶可以用于奶牛隐性乳房炎的预防,可快速降低牛奶中的体细胞数,减少抗生素的使用和提高牛奶的品质。2015年该团队又成功开发出四类新兽药——重组溶葡萄球菌酶阴道泡腾片[(2015)新兽药证字38号],用于母猪生殖疾病的预防和治疗,可显著提高母猪的产仔率和胎次,降低饲养成本,提高养猪户的收益。

4.载溶葡萄球菌酶纱布创面敷料三类医疗器械和复合溶葡萄球菌酶消毒剂的研制

研究团队将溶葡萄球菌酶技术应用到医疗器械领域,研制成兼具杀菌抗感染和促进创面愈合作用的纱布创面敷料。该成果杀菌机理独特,不同于抗生素,能有效杀灭各种致病菌,包括耐药菌MRSA,同时细菌不易产生耐药性。另外,溶葡萄球菌酶属生物酶类物质,对破损皮肤黏膜无刺激和毒副作用,不引起疼痛。与国内外其他化学类和抗生素类烧伤及创面的抗菌产品相比,具有不会产生耐药性、杀菌谱广、效率高、无毒无刺激、安全性高、促进创面愈合、伤口不粘连等优点,为院内控制MRSA引起的创面感染提供一种新的有效途径。

他们用溶葡萄球菌酶和溶菌酶复配,研制出一系列可以高效杀菌的生物消毒剂产品,如复合溶葡萄球菌酶消毒剂[卫消字(1999)第0017号]、吾爱牌复合溶葡萄球菌酶消毒洗液[卫消字(2001)第0046号]、百克瑞牌复合溶葡萄球菌酶消毒剂[卫消字(2001)第0047号]、新净界牌复合溶葡萄球菌酶口腔消毒喷雾剂[卫消字(2002)第0006号]、新净界牌复合溶葡萄球菌酶口腔消毒喷雾剂(儿童型)[卫消字(2002)第0052号]、百克瑞牌复合溶葡萄球菌酶消毒喷剂[卫消字(2002)第0062号]等产品。

(三)抗菌肽的研制

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽,分子量在2 0007 000,由2060个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。抗菌肽一般是通过裂解细菌细胞膜或在细菌细胞膜上穿孔而杀死细菌。

研究团队在对天然抗菌肽的序列和结构分析的基础上,设计并合成了一系列多肽,经过体内外抗菌活性检测和初步的安全性研究,筛选出具有高效抗菌活性和安全性好的抗菌肽——GK抗菌肽,GK抗菌肽是一种α螺旋-铰链-α螺旋结构,它作用于细菌细胞膜的方式是通过裂解细菌细胞膜,使得细菌内活性物质迅速泄漏而杀死细菌,在1分种内杀死细菌,大大优于传统抗生素。抑菌试验检测结果显示,最小抑菌浓度仅为1微克/毫升。目前已自主研发了十余条GK抗菌肽,对多种耐药菌如绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼氏不动杆菌、耐药性金黄色葡萄球菌等都有很好的杀菌效果。发明专利“一组合成抗菌肽”(ZL02136766.3)获得上海市第十八届优秀发明选拔赛一等奖。

(四)噬菌体裂解酶

 随着耐药菌感染问题在临床上的日益严重,新型抗菌药物的研发越来越迫切。噬菌体裂解酶是近年来抗感染药物研究的一个热点,其杀菌机制与传统抗生素不同,具有杀菌速度快、特异性高、不易诱导细菌耐药性等特点。目前有多个作用于革兰氏阳性菌(G+菌)的噬菌体裂解酶已进入临床研究,但作用于革兰氏阴性菌(G-菌)的抗菌蛋白研究进展缓慢。

研究团队从噬菌体中筛选到一种全新的噬菌体裂解酶AB09,体外试验表明,其能在60分钟内快速裂解临床分离的多种耐药G-菌,包括耐药性问题特别严重的鲍曼不动杆菌和绿脓杆菌等。新型抗菌药物的研发将为临床多重耐药菌的防治提供新的方法。

二、创新点

(一)实现重组溶葡萄球菌酶大肠杆菌外分泌表达

由于Staphylococus Simulans产溶葡萄球菌酶少且本身属于病原菌,因此国外研究者从20世纪80年代通过分子克隆方法将溶葡萄球菌酶基因在枯草芽孢杆菌及乳酸杆菌中进行表达。由于宿主菌潜在生物安全性要有非常慎重的考虑,目前已经通过美国FDA评审的生物制品的表达宿主菌主要为大肠杆菌和酵母菌。研究团队在大肠杆菌E. coli中外分泌表达出溶葡萄球菌酶,市场前景良好。

(二)攻克蛋白酶规模化生产的工艺技术难题和常温下的稳定性难题,为申报一类新生物制品新药和应用打下基础

研究团队解决了扩大生产规模的工艺技术问题,一克纯酶的价格降低到2万元人民币以下,为蛋白酶的工业化应用打下基础。还解决了溶葡萄球菌酶在常温下特别是在水溶液中极不稳定的问题,使其水溶液在常温下放置两年,活性不发生任何改变。在此基础上配制了十余种生物消毒产品,其中一个获III类医疗器械注册证,7个或生物消毒剂许可证,11个产品入选上海高新技术成果转化项目,目前这些产品都已经成功实现了产业化,年销售额近亿元。相关技术成果获得了2005年度上海市科技进步一等奖。

(三)开创国内生物消毒制剂的新领域

研究团队提出了“生物杀菌”的新概念,即用抗菌酶或抗菌肽取代部分抗生素、化学消毒剂,如复合溶葡萄球菌酶消毒剂,核心成分是生物蛋白酶,破壁杀菌,细菌不易产生耐药性,经代谢后为氨基酸和水,无药物残留,对环境友好。这些生物消毒剂对破损皮肤和粘膜无刺激性和毒副作用,杀菌效率高且不易产生细菌耐药性,目前这些产品已广泛用于临床耐药性细菌感染的防控,产生了显著的经济和社会效益。

三、推广应用

(一)“百克瑞”牌消毒剂系列研发

已获得国产消毒剂卫生许可批件,并被认定为“上海市新产品”和“上海市高新技术成果转化项目”,主要用于局部消毒,目前已经开发成“百克瑞”牌系列消毒剂,广泛用于烧伤整形科、血管外科、肛肠科、骨科等对创面局部细菌感染,特别是耐药性细菌的感染的治疗。

(二)“新净界”牌消毒剂系列研发

该成果是以复合溶葡萄球菌酶为原料生产的新型生物型消毒杀菌产品,被上海市认定为“高新技术成果转化项目”,主要用于口腔内部消毒。通过在多家医院口腔科对牙周病、口腔黏膜溃疡等口腔疾病的治疗发现,该喷雾剂对口腔和牙龈急性炎症,有良好的治疗作用。临床还观察到,该成果对复发性口疮,能明显地延长缓解期,减少复发次数。

(三)百克瑞“杀菌纱布”

2016年,上海各医院使用这种生物创面敷料超过24万人次。中国中医科学院广安门医院、北京中医药大学东直门医院以及北京市肛肠医院对肛瘘术后疗效的临床观察研究显示:使用此种生物创面敷料,缩短创面愈合时间45天,人均节约诊疗费用514元。

后记

新型生物杀菌产品的研制和产业化推进了生物抗耐药菌、生物消毒行业技术进步和学科发展。上海高科生物工程有限公司的研究团队自1997年起,历经5年的临床前试验,通过瑞金医院、长海医院、304医院的20余项的临床试验,终于获得首个生物消毒剂批件。在研究团队的推动下,2002年中华预防医学会消毒学会在上海成立生物消毒学组,标志“生物消毒”学科方向正式获得学术界认可。2005年,载生物酶杀菌纱布三类医疗器械获SFDA批准上市,十余年来,该产品在临床耐药菌的防控方面起到了非常重要的作用,在控制院内感染,减少感染患者住院时间和节约医疗费用方面得到医护人员的广泛认可。2009年“重组溶葡萄球菌酶粉”实现了生物抗菌酶在养殖业抗耐药菌的应用。溶葡萄球菌酶很好地解决了高产量、高纯度和规模化生产中许多复杂的技术问题,逐步获得了国家相关部门和学者的认可,具有良好的推广应用前景。

专家简介

黄青山博士,教授级高级工程师,上海高科生物工程有限公司首席技术官,上海高科联合生物技术研发有限公司总经理。多年来一直专注于新型抗菌产品特别是抗耐药菌的生物酶和抗菌肽的研发和产业化。先后研发了含有溶葡萄球菌酶的三类医疗器械(纱布创面敷料)、复合溶葡萄球菌酶消毒剂、一类新兽药外用重组溶葡萄球菌酶粉等10余项成果,广泛用于多种临床感染性疾病的预防和治疗,特别是耐药性细菌的感染。溶葡萄球菌酶及其下游产品的产业化技术先后获得了上海市科技进步一等奖、广东省科技进步一等奖、江苏省科技进步二等奖、入选上海市优秀发明选拔赛发明产品推广实施金奖、第六届国际发明展览会金奖,入选国家新产品、上海市新产品名录。

作为项目负责人,主持承担了30余项国家及地方科研项目,其中2项国家863科技计划项目,2项国家科技支撑计划项目、2项国家重大新药创制专项项目(成药性研究和滚动)、1项国家高技术专项项目、1项江苏省重大成果转化项目及10余项省市级研究项目等。发表各类学术论文70余篇。