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基于小胶质细胞p38MAPK通路的电针镇痛机制研究

2017-10-13

 神经病理性疼痛(neuropathic pain)指中枢或者外周神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征,以自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏为特征。长期以来对疼痛的研究主要集中在对以神经元构成的神经网络以及神经元释放的各类神经活性物质的作用的观察。近年来,虽然人们对疼痛的认识有了长足的进步,但仍然无法对疼痛产生的机制作出满意的解释,尤其对一些特殊的疼痛现象无法给予解释,如“镜像痛”、幻肢痛、痛过敏、损伤范围外的疼痛等。此外,临床上应用单一针对神经元机制设计的镇痛药物,其镇痛效果十分有限,并有众所周知的副作用。因此,探索神经病理性疼痛产生的机制、寻求有效的镇痛手段一直是近年来痛觉研究的热点之一。

浙江中医药大学梁宜博士在浙江省自然科学基金青年项目(编号:Y2091151)的支持下,开展了“基于小胶质细胞p38MAPK通路的电针镇痛机制研究”(项目完成人:梁宜、杜俊英、方剑乔、房军帆、邱宇洁、刘晋、祝骥 ),旨在通过观察实验性慢性神经病理性疼痛时脊髓不同类型胶质细胞活化及电针的干预情况,初步明确脊髓不同类型胶质细胞活化在电针抗神经病理性疼痛的作用。通过观察电针疗法在治疗早期慢性神经病理性疼痛中对脊髓小胶质细胞活化的影响及其对p38MAPK通路的干预,从新的角度揭示部分针灸镇痛作用原理,为针灸临床镇痛提供新的实验研究基础,推动针灸疗法在临床慢性神经性疼痛的治疗中的广泛应用。

一、研究内容

(一)电针对L5脊神经结扎大鼠腰段脊髓背角胶质细胞活化的干预研究

选用SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠83只。参照Sun Ho Kim的方法行L5脊神经结扎术(SNL),诱发大鼠神经病理性疼痛,建造疼痛模型。除了N组,其余大鼠均接受SNL手术。

1.分组与治疗

实验大鼠随机分为:(1)空白对照组(N组),共14只,其中8只进行全程痛阈测量和免疫荧光组织化学法检测(术后14天),6只用于ELISA检测;(2)模型对照组(SNL组),共27只,其中9只进行全程痛阈测量和免疫荧光组织化学法检测(术后14天),术后3天和7天免疫荧光组织化学法检测各6只,ELISA检测6只;(3)电针治疗组(EA组),共27只,动物分配同SNL组;(4)假手术组(Sham-SNL组),共15只,其中9只进行全程痛阈测量和免疫荧光组织化学法检测(术后14天),6只用于ELISA检测。

EA组大鼠固定后,取双侧“足三里”“昆仑”(参照华兴邦大鼠穴位图谱),采用0.25毫米×13毫米灸针刺激,进针后使用“HANS-100型韩式穴位暨神经刺激仪”连接两穴,治疗参数为:疏密波、频率2/100赫兹,刺激强度:先1毫安治疗15分钟,再2毫安治疗15分钟,共30分钟、1次/天。N组、C组、Sham-SNL组大鼠:仅给予EA组大鼠相同的固定。

2.指标检测

对各实验组进行痛阈检测、脊髓背角GFAP和OX-42阳性细胞数检测、免疫荧光双标法检测腰段脊髓背角p-p38MAPK与OX-42、GFAP的共表达检测,患侧脊髓背角IL-1β、IL-6含量检测。

(二)电针抗神经病理性痛及其对脊髓小胶质细胞p38MAPK活化的干预

选用SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠78只,采用PE-10管进行大鼠腰段脊髓鞘内置管,并剔除置管失败大鼠8只。

1.实验分组及疼痛模型建造

将70只置管成功大鼠完全随机分组为空白对照组(N组,n=10)、模型对照组(SNL组,n=12)、电针治疗组(EA组,n=12)、抑制剂组(SB203580组,n=12)、电针+抑制剂组(EA+SB203580组,n=12)、假电针组(Sham EA组,n=12)。

对大鼠进行L5脊神经结扎,共剔除SNL术失败大鼠6只,SNL组和SB203580组各1只,EA+SB203580组和Sham EA组各2只。

2.处理方法

N组大鼠不接受任何处理;SNL组大鼠仅接受与EA组相同的固定处理;EA组大鼠固定后接受电针治疗,具体参数同实验一,连续治疗3天;Sham EA组大鼠固定后,取EA组相同穴位用针灸针仅浅刺皮下,未接电针仪;同时以上四组大鼠均以5微升/分钟的速度鞘内注射2%DMSO,10微升 /天,1次/天,持续3天。SB203580组大鼠则鞘内注射10微升 SB203580溶液(浓度30nmol/10微升);EA+SB203580组大鼠同时接受同SB203580组鞘内注射SB203580和同EA组的电针处理。

3.指标检测

对各实验组进行痛阈检测、免疫荧光双标法检测腰段脊髓背角p-p38MAPK与OX-42、p-p38MAPK与GFAP的共表达检测、Western blot法检测腰段患侧脊髓背角p-p38MAPK、p-ATF2的蛋白表达检测。

二、研究成果

实验结果表明,实验大鼠于SNL术后各时点痛阈均出现明显降低,成功复制大鼠神经病理性疼痛模型;单纯EA或EA联合SB203580治疗均能显著提高SNL大鼠痛阈。SNL大鼠患侧腰段脊髓背角GFAP和OX-42阳性细胞表达显著增多,而正常大鼠仅有少量表达;患侧脊髓背角GFAP阳性细胞表达于术后7天达最高峰,而OX-42阳性细胞于术后3天到达最高峰,EA可显著抑制星形胶质细胞和小胶质细胞活化。免疫荧光双标法检测结果显示SNL大鼠患侧腰段脊髓背角中p-p38MAPK与OX-42阳性细胞存在共表达,证实p-p38MAPK存在于小胶质细胞,而非星形胶质细胞。

术后3天,SNL大鼠健患侧腰段脊髓背角浅层p-p38MAPK、OX-42阳性细胞表达均显著增多,但健侧增幅较小。接受EA、SB203580或两者联用治疗后,三治疗组大鼠患侧腰段脊髓背角浅层p-p38MAPK、OX-42阳性细胞表达明显减少,且EA组和EA+SB203580组明显少于SB203580组。对于健侧而言,三治疗组大鼠健侧腰段脊髓背角浅层p-p38MAPK阳性细胞表达亦显著减少,且对健侧脊髓背角浅层OX-42阳性细胞的抑制以EA+SB203580组最为显著。SNL大鼠患侧腰段脊髓背角p-p38MAPK、p-ATF-2蛋白表达在术后3天时显著增多;三治疗组大鼠患侧腰段脊髓背角p-p38MAPK、p-ATF-2蛋白表达较SNL组呈下调趋势。

三、科学意义

传统观念认为疼痛的发生和维持仅与神经元有关,神经胶质细胞长期以来被认为是中枢神经系统中神经元的间质细胞或支持细胞。但近年来研究发现,神经胶质细胞在痛觉调控机制中发挥重要作用,胶质细胞-神经元网络的研究已成为目前神经科学研究领域的热点。该项目较为全面地观察电针疗法对神经病理性疼痛大鼠中枢小胶质细胞的不同时期活化的干预作用,从神经-免疫调控这一新角度初步探讨电针镇痛作用机制。

针灸镇痛的信号转导机制研究是一个新的研究方向。神经小胶质细胞是中枢神经系统中的免疫细胞,活化的小胶质细胞能发挥免疫细胞的功能,释放前炎症细胞因子,介导痛觉过敏。p38MAPK通路是活化的小胶质细胞分泌炎性细胞因子的主要信号转导通路之一,且研究证实p-p38MAPK仅共存于小胶质细胞内。通过较为全面地观察电针对“小胶质细胞活化→p38MAPK磷酸化→ATF-2磷酸化→促炎性细胞因子释放→小胶质细胞活化”通路各环节的干预作用,率先开展电针疗法对神经病理性疼痛相关中枢小胶质细胞p38MAPK通路的系统性研究,创新研究针灸镇痛效应原理的新领域,从胶质细胞信号转导机制阐述针灸镇痛的神经生物学基础。

专家简介

梁宜,医学博士,浙江中医药大学第三临床医学院副研究员、硕士生导师,附属第三医院主任医师。现任浙江省针灸学会理事、浙江省针灸学会青年理事会主任委员、浙江省中西医结合学会疼痛专业委员会常委、浙江省中医药学会博士学术分会常委、中华中医药学会疼痛分会和中国针灸教育分会委员、浙江省针灸学会现代研究专业委员会委员。曾获霍英东青年教师奖、全国高等中医药院校“优秀青年”、江浙沪中西医结合优秀青年人才奖、浙江省医坛新秀等荣誉称号,是浙江省151人才工程第二层次培养对象。先后主持国家自然科学基金项目2项,浙江省自然科学基金等省部级课题3项、厅局级课题4项。发表论文30余篇,其中SCI收录6篇,参编著作和教材6部。曾获中国针灸学会科技进步二等奖1项,国家教育系统优秀科学研究成果二等奖1项,浙江省科技进步三等奖2项,浙江省中医药科学技术奖3项。