打破国外技术垄断的蛋白质组学研究及糖尿病诊断新装备——国家重大科学仪器设备开发专项“双向凝胶电泳（2DE）成套设备技术开发与应用的研究”取得突破性进展

2016-02-25

双向凝胶电泳（2DE）是公认的分离效率高的整体蛋白质分离技术，是复杂蛋白及其蛋白组学研究的标准分离技术，2DE与生物质谱结合被认为是展示和规模化分析蛋白质，特别是蛋白质组的常规技术。并且，2DE的第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等可单独用于上述领域的日常分离分析与生物制品质量控制等工作，应用广泛。目前美国几家公司垄断了相关的成套设备、耗材和试剂等国际市场。相反，本土电泳企业缺少成套的2DE仪器设备、关键部件和技术，整体竞争力不足。

鉴于上述情况及课题组在电泳学新概念、新理论、新技术和新方法——移动反应界面（MRB）电泳领域雄厚的研究基础，牵头单位上海交通大学联合复旦大学、中国人民解放军军事医学科学院、华南理工大学、同济大学、交大医学院附属瑞金医院、广州万孚生物技术有限公司、北京六一科学仪器厂、温州安德森生物科技有限公司及上海华质生物技术有限公司等单位开展了国家重大科学仪器设备开发专项项目“双向凝胶电泳成套设备技术开发与应用的研究”（项目编号：2011YQ030139）。项目旨在凝聚国内上述领域的优势团队，研制并生产具有我国自主知识产权的成套2DE技术设备及糖尿病糖化血红蛋白聚焦电泳诊断仪，应用于肝脏和胃癌等蛋白质组学研究及糖尿病诊断中。

一、工作目标

紧紧依靠我国在电泳新概念、新理论和新技术（包括MRB、IEF动力学、制冷与散热、电泳染色技术）等方面的突破，研制并生产具有我国自主知识产权的成套2DE仪器设备与技术。包括关键pH梯度胶条、高分辨IEF分离介质分离室、稳定PAGE凝胶，六种高灵敏蛋白染色试剂盒等关键材料和试剂，第一向IEF电泳仪、第二向SDS-PAGE电泳仪等仪器设备。2DE的整体性能达到美国GE等公司同类产品水平，三个关键指标（稳定性、分离效率和灵敏度）达到甚至高于GE同类产品。依托国内权威研究机构，开展2DE成套技术在肝脏和胃癌等蛋白质组学领域的应用与功能开发研究，形成配套和应用示范。基于IEF关键技术突破，开发糖尿病IEF诊断仪。

二、项目进展情况

该项目自2011年10月获得立项后，经参研单位及应用单位共同努力，在整机集成及关键部件和材料研发方面取得了突破性进展（图1）。

研制了具有蛋白样品前处理质量识别能力的IEF电泳仪，实现了7个功能和4个软件开发集成。仪器的稳定性高，具有六通道电压和电流单独设定功能。电泳仪装置采用人机交互界面（触摸屏）。

研制了与IEF电泳仪配套使用的90种IPG胶条，稳定性和分辨率较好，高速IPG预制胶条比同类产品聚焦时间缩短三分之一，超高分辨的IEF胶条解决了目前国际上无法解决的蛋白同系物分离的难题，且与主流2DE设备全面兼容（表1）。具备IEF关键试剂的规模合成能力（20多种IEF关键试剂）。

研制了PAGE电泳系统，包括六板凝胶电泳仪、PAGE电源，PAGE电泳仪采用独特的热交换冷却系统。合成了72种PAGE预制胶。该PAGE预制胶分离条带窄，锐度好，重现性好，电泳速度快（1小时），可与众多公司的电泳装置联用。

研制了全自动凝胶染色仪，减少人为因素导致的误差，避免了操作者直接接触试剂。研发了蛋白质染料染色、蛋白质银染和蛋白质负染等5个试剂盒。糖蛋白染色技术可在2小时内完成操作，灵敏度达4～8ng/mm²，可与经典的Pro-Q Emerald 488相媲美。磷酸化蛋白染色技术可在90分钟内完成操作，灵敏度达16～32ng/ mm²，与经典的Pro-Q Diamond相近。

开发了与自主研发的2DE成套仪器相配套的图像扫描分析软件，包括图形数据读入与存储、基本数据处理和参数设定、蛋白中心提取与边缘检测算法、图形分割与修正及2DE图像分析蛋白质点匹配模块，实现了对凝胶图片的一系列操作。

研发了蛋白样品前处理装置——制备凝胶电泳分离洗脱装置和自平衡自由流电泳设备（图2）。前者包括制备电泳分离装置和制备电泳收集装置，可以成功进行标准品和实际样本的分离和收集，并且在蛋白的分离上接近分析型凝胶电泳的分辨率，在蛋白的收集上达到70%以上的回收率，高于一般分析型凝胶电泳通过酶切提取肽段的回收率。后者为重力自平衡自由流电泳装置，总共有6个型号。该仪器在第十五届中国国际工业博览会和第十五届中国国际高新技术成果交易会获得高校展区奖和优秀产品奖。

研制出糖尿病IEF诊断仪（图3）及技术体系。糖尿病IEF诊断仪主要特点如下：12管/次，批量电泳；程控电压，电泳过程可视，时序可调节；电泳后原位对比，自动图像校准、测量；结构可靠性、方便性提高，重复稳定。

在临床样本的采集和胃癌研究方面，以分子标志物为切入点，以高通量组学技术为基础，筛选出胃癌相关的分子标志物，对胃癌候选分子标志物进行了生物学功能研究。通过胃癌细胞蛋白质组学分析发现FLNC与转移相关，发现了FSTL1是胃癌潜在标志物，提出ARID1A抑制胃癌细胞转移的分子机制。同时，进行了胃癌细胞膜蛋白质组学研究和胃癌血清样本iTraq-LC-MSMS研究。

在糖尿病诊断方面，初步建立了糖尿病IEF诊断仪的诊断标准以及糖尿病IEF诊断仪设备技术的技术标准。完成了人群身高、体重、血压等人体测量学检查，使用标准化问卷对其生活方式、饮食习惯、疾病史、用药史情况进行了采集。完成了其他生化及相关并发症数据采集指标：糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹及餐后血糖、血尿酸、炎症因子；总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、肝功能、肾功能等。进行了糖尿病及糖尿病前期大血管与微血管病变的筛查及早期诊断，确定并发症患病率及患病人群数据库。

三、应用前景

在我国，2DE的市场规模每年在11亿以上。随着国家对生物医药的投入增加，市场规模将进一步扩大。现有电泳企业有较广泛的销售渠道，更重要的是开发的2DE系统具有较强竞争力。因此，相关产品市场占有率将稳步提升。开发的制备型电泳系统、蛋白染色试剂盒和2DE图谱扫描处理软件均针对实际应用设计研发，并能与开发的2DE系统形成配套。因此，这三项开发具有很好的产业化前景。糖尿病糖化血红蛋白检测为新兴市场，我国糖尿病人口和糖尿病前期人口非常巨大，糖尿病IEF诊断仪具有广阔的产业化前景。

IEF关键部件IPG胶条、PAGE预制胶、自由流电泳仪及五种蛋白质检测试剂盒正处在市场推广阶段，IPG胶条和PAGE预制胶已经复旦大学、中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所试用，蛋白检测试剂盒经中科院生物物理研究所、清华大学、浙江大学、浙江省亚热带作物研究所、温州医科大学和深圳市福田疾控中心等单位试用，反馈意见良好，市场前景广泛。

整体来看，通过四年的国家重大科学仪器设备开发专项的实施，科研团队研发并生产了2DE成套技术设备，其中样本与处理设备——制备凝胶电泳分离洗脱装置、自平衡自由流电泳设备和糖尿病糖化血红蛋白聚焦电泳诊断设备研制成功。技术指标已全部完成，特别重要的是2DE一些技术性能（如可调控IEF、可调控2DE、样本自识别等）的提出，一些技术指标（如高速高分辨IPG胶条、特种IPG胶条、高灵敏糖蛋白染色）具有独特优势。有关的技术转让已经签订或正在商谈，相关的2DE技术设备和自由流电泳技术等已实现产业化，并正在积极拓展欧美等发达国家市场。发表相关SCI论文70余篇。

项目负责人简介

曹成喜，上海交通大学教授、博士生导师。2000年于中国科技大学化学系获理学博士学位，毕业后留校工作。2002年至今任职于上海交通大学生命科学技术学院。2006年曾赴澳大利亚La Trobe大学作学术交流访问。现任国家重大科学仪器设备开发专项首席科学家和技术专家委员会副主任、医工（理）重大项目咨询专家、通用电泳设备国家标准委员会委员、中国化学会有机与生化分析专业委员会委员、第七届至第九届全国微纳生物化学分离分析会议学术委员会委员、J BiochemMol Bio Res和TOACJ期刊编委。曾荣获安徽省骨干教师、上海交通大学优秀教师和优秀科研团队等荣誉奖励。应邀为英国Analyst、Electrophoresis、Anal BioanalChem和Anal ChimActa等国际主流期刊撰写并发表评论性综述和论文，在国际和国内会议作邀请报告数十次，为Anal Chem、BiosenBioelectr、Electrophoresis和J Chromatogr A等十多种学术期刊担任特邀论文评议人。先后主持20多项科研项目，包括首批国家重大科学仪器设备开发专项1项、国家自然科学基金重点项目1项及面上等课题7项、上海市重点项目1项，国家973计划子课题1项、国家863计划重点支撑项目子课题1项、安徽省自然科学基金1项、国家卫生领域课题1项、安徽省课题4项、横向课题6项。主编《生化分析技术》和《生物化学仪器分析基础》教材2部。先后在BiosenBioelectr、Anal Chem、JChromatogr A和Electrophoresis等学术期刊发表论文120余篇（其中SCI收录论文100余篇）。