胰岛素早期强化治疗 NOD 鼠和 1 型糖尿病儿童影响其胰岛β细胞凋亡和再生的实验研究

2015-06-22

1型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一种由于自身免疫反应引起胰岛β细胞损伤，导致内源性的胰岛素分泌绝对缺乏，从而引起血糖升高等一系列临床症状的疾病。儿童1型糖尿病发病急骤，近年发病率呈上升的趋势。其发病原因和机制迄今尚未完全阐明，多数认为 T1DM 是在遗传易感性基因的基础上，外界环境因素的诱导作用下，引起自身免疫功能紊乱，导致胰岛β细胞的损伤和破坏，最终导致胰岛β细胞功能衰竭而发病。近年来，国内外以胰岛素及衍生物对T1DM的免疫预防研究为多，而忽略了其抑制胰岛β细胞凋亡和促进胰岛β细胞再生的治疗作用，理论上也许免疫预防有一定效果，但是有关预防用药时间、剂量和途径等因素仍无定论。因此，目前T1DM最理想的治疗方法是通过早期大剂量胰岛素来抑制胰岛β细胞凋亡和促进β细胞再生。

山东省立医院李桂梅教授团队开展的胰岛素早期强化治疗NOD鼠和1型糖尿病儿童影响其胰岛β细胞凋亡和再生的实验研究，从动物实验和临床两方面进行探讨，动物实验部分旨在观察胰岛素强化治疗对发病初期NOD小鼠的治疗效果，并比较不同治疗方案在不同治疗时间下，胰岛素对胰岛β细胞凋亡和再生的影响，重点观察早期大剂量强化应用胰岛素对NOD小鼠胰岛β细胞、血糖、胰岛炎、Bcl-2蛋白、Bax蛋白、T细胞亚群、胰腺十二指肠同源盒（Pancreatic and duodenal homebox-1, PDX-1）mRNA等的影响。临床部分旨在观察胰岛素强化治疗对初发的T1DM患儿的疗效，并比较不同治疗方案在不同治疗时间下，对T1DM患儿糖化血红蛋白、C-肽、胰岛素、胰岛素样生长因子-1（insulin-likegrowth factor 1, IGF-1）、血清细胞因子IL-4和IFN-γ等的影响。研究在国内外较早探讨糖尿病发病后的NOD鼠和儿童，在不同时间和不同剂量胰岛素干预下对胰岛β细胞凋亡和再生的影响，从而阐述早期胰岛素强化治疗措施的重要性，为临床提供实验理论依据，为更好地治疗自身免疫性糖尿病提供了一条新途径。

    一、实验方法

实验一：选取近期发病NOD小鼠30只，随机平均分为A、B、C、D、E5组。A、B、C、D组自由进食，每日09:00分别皮下注射甘精胰岛素0.1IU/g、0.05IU/g、0.015IU/g以及PBS5µL；E组采用强化治疗，每日09:00皮下注射甘精胰岛素，并平均分六次（12:00起）予以食物1h，进食前皮下注射门冬胰岛素。依据血糖测得值及小鼠进食情况及时调整胰岛素用量。同时选取同周龄未发病组小鼠为F组。观察各组治疗第4天24h血糖变化及第15天疗效。HE染色观察D、E、F组小鼠胰岛炎性积分，免疫组化观察小鼠胰岛bax、bcl-2蛋白的表达。

实验二：12～14周龄近期发病NOD小鼠30只随机分为早期强化治疗组（EIT组）、早期常规治疗组（ECT组）、晚期强化治疗组（LIT组）、晚期常规治疗组（LCT组）、未治疗对照组(DM组）五组，另选取同周龄未发病雌性NOD小鼠6只为正常对照组（NC组）。比较EIT组与其他各组体质量、24h动态血糖及干预治疗后脾脏和胸腺T细胞亚群的变化情况。提取淋巴细胞与胰岛β细胞NIT-1，共培育接种在4块6孔板中，按添加胰岛素时间（12h，24h，36h，48h）不同分为4组，同一时间按每孔添加胰岛素浓度不同（0.5µg/ml，1.0µg/ml，2.0µg/ml，0µg/ml，正常对照组）分为5组，提取RNA，观察PDX-1mRNA表达情况。

实验三：初发糖尿病酮症酸中毒1型糖尿病儿童75例分为三组：CSII组，12例，平均年龄（9.0±1.9）岁，采用胰岛素泵持续输注速效胰岛素类似物门冬胰岛素强化治疗；TDI组，30例，平均年龄（9.2±2.5）岁，采用诺和灵30R一天早晚餐前注射两次；MDI组，33例，平均年龄（8.7±2.0）岁，采用门冬胰岛素三餐前皮下注射+长效胰岛素类似物甘精胰岛素睡前一次皮下注射，一天注射4次强化治疗。观察治疗3m期间血糖波动（最高及最低血糖之差：BG-F），治疗前后糖化血红蛋白（HbA1c）、每天胰岛素用量、血清C肽变化，蜜月期开始和持续时间，观察C-肽与HbA1c和BG-F的直线相关关系。

实验四：非初发糖尿病酮症酸中毒的39例1型糖尿病患者，根据不同治疗方案不同病程随机分为4组：早期强化治疗组（IIT）组，11例，平均年龄（7.1±3.1）岁；晚期IIT，14例，平均年龄（5.9±2.9）岁；早期传统治疗组（CIT）组，6例，平均年龄（8.2±2.9）岁；晚期CIT组，8例，平均年龄（6.3±2.8）岁。比较治疗前和治疗3个月后，各组IGF-1、INF-γ、IL-4水平。

二、主要结论

1．采用甘精胰岛素和门冬胰岛素联合治疗，对于发病早期NOD小鼠的血糖均值、血糖波动范围、正常血糖所占比例均优于单用一天一次甘精胰岛素组。

2．早期胰岛素持续皮下注射速效胰岛素强化治疗新发1型糖尿病儿童与每日使用2次诺和灵30R和三餐前门冬胰岛素联合甘精胰岛素强化治疗相比，更有效改善血糖波动，减少每日胰岛素总用量，使蜜月期延长，是1型糖尿病较理想的治疗方案。

3．不同时间不同治疗方案比较，胰岛素早期强化治疗可以通过调节宿主脾脏和胸腺淋巴细胞亚群的变化抑制自身免疫反应，减轻NOD鼠胰岛炎症，减少胰岛细胞凋亡，同时促进胰岛β细胞再生。

4．不同时间不同治疗方案比较，胰岛素早期强化治疗可以通过调节血清细胞因子变化抑制自身免疫反应，保护胰岛β细胞免受破坏，同时促进再生因子表达。

课题组通过动物和临床实验证实了早期胰岛素强化的治疗作用。胰岛素具有低毒性、来源广泛、制备方便的特点，更具临床实用价值。胰岛素早期强化治疗可使其内源性胰岛素增加，外源性胰岛素需要量减少，使蜜月期提前出现并维持较长时间，预防急性和慢性并发症的发生，保证患儿健康成长。

课题负责人简介

李桂梅，博士，教授，博士生导师，主任医师，山东省立医院大科副主任、儿科内分泌综合科科主任，山东省立医院第一届“十佳女医师”，全国儿科内分泌遗传代谢学组委员，美国UAB大学儿科内分泌高级访问学者。擅长诊治儿童矮小症（如生长激素缺乏症、垂体柄阻断综合征、空蝶鞍、颅咽管瘤术后、多种垂体激素缺乏症或全垂体功能低下、特发性矮小、小于胎龄儿、先天性卵巢发育不良等）、性早熟、糖尿病、尿崩症、甲亢、甲低、小阴茎、小睾丸、先天性肾上腺皮质增生症、佝偻病、肥胖症及各种综合症等。多年来主编著作3部，发表论文上百篇。科研成果曾获山东省科研二等奖1项、三等奖4项。