红叶石楠良种选育及沙冬青抗寒基因克隆与新种质创制

2014-01-24

红叶石楠（Photinia×fraseri‘Red Robin’）是起源于亚热带的常绿灌木树种，是重要的园林观赏树种，被誉为“红叶绿篱之王”。由泰安市泰山林业科学研究院主持承担的“红叶石楠良种选育及沙冬青抗寒基因克隆与新种质创制”项目，针对我国园林绿化树种不适应北方冬季的寒冷气候，容易造成冻害的情形，自2001年开始对红叶石楠进行引种试验，同时与中国科学院遗传发育生物学研究所合作，开展对林木抗寒基因的克隆和遗传转化的研究。研究人员通过良种选育、克隆木本植物沙冬青抗寒基因（AmEBP1和AmGS），利用根癌农杆菌介导遗传转化，将AmGS基因导入珍贵园林绿化树种红叶石楠中，开辟了利用高新技术培育抗寒林木新种质的新途径。项目2009年得到山东省科技攻关项目资助，主要完成人有王迎、孙海伟、黄艳艳、罗磊、孔令刚等。

1．选育了“鲁宾斯”红叶石楠抗寒良种。从引种驯化红叶石楠变异群体中初选出多年在泰安从未受过严重冻害植株80株，经对比试验，筛选出山东泰安自然条件下越冬枝叶，冻害死亡率平均在10%以下，整株没有死亡现象；春天从3月8号开始萌动，较对照提早6天；整个品种在自然生长状况下的红叶期为168天，较对照延长了13天。利用一年生枝条，扦插平均生根率92%，双舌接成活率达78%，劈接成活率为62%。2008年通过山东省林木良种审定鲁S-ETS-PG-011-2008，定名为“鲁宾斯”红叶石楠。

2．采用分子克隆方法（cDNA-AFLP 和RACE）在国际上率先从沙冬青中克隆出了木本植物抗寒基因AmEBP1和AmGS，有关论文已发表在Plant Molecular Biology、Preparative Biochemistry & Biotechnology和Gene上。

3．建立了高效红叶石楠再生体系和高效基因转化技术体系；对转基因株系进行了PCR、Southern、RT-PCR分析，证实AmGS基因已经整合到转基因红叶石楠基因组DNA中，且在转录水平表达；对转基因株系连续6次扦插继代植株进行了PCR测定，导入的AmGS基因在继代植株中能够稳定地传递下去。

4．通过对转基因株系与未转基因株系抗寒性及生理对比检测，获得了4个抗寒性明显提高的转基因组培苗株系（R3， R5， R6，R7）。它们的株LT₅₀都明显低于未转基因对照植株（低4℃左右）。这些转基因株系在冷冻条件下REC升高程度明显低于未转基因对照植株，SOD、POD活性、可溶性蛋白含量转基因高于对照组。这些抗寒性相关生理指标的检测结果表明，转基因株系的抗寒能力有了提高。

5．经田间对比试验，转基因红叶石楠在田间低温下的冷害指数为2.833，较对照未转基因提高97.7%；转基因红叶石楠在露天条件下能够安全越冬，只有少部分的叶片和新稍发生冻害，越冬枝叶冻害率低于10%。转基因红叶石楠在试验地立地条件下，生长性状表现一致，抗逆性、观赏性都表现出很强的优势。

6．经对转基因红叶石楠根际的土壤微生物影响分析，转基因红叶石楠根际的细菌菌群数量变化最大，对微生物总体组成影响不大，以细菌数量最多，真菌和放线菌次之；在细菌菌群中以芽孢杆菌属的细菌为主，未发现土壤中有AmGS基因漂移现象。

　　该项研究所获得的抗寒红叶石楠良种，经田间栽培后，可降低60%以上由于冻害所造成危害。2009年以来，山东省28个县级以上城市已应用“鲁宾斯”红叶石楠12万株，创造了经济效益6000万元以上。