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默然耕耘二十载 尽在蟹业写春秋——中国科学院海洋研究所崔朝霞研究员“三疣梭子蟹育种的遗传学基础”成果展示
2013-07-26
三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）广泛分布于我国从北到南包括渤海、黄海、东海和南海等各沿海区域，是深受大众喜爱的高档水产品。近年来，我国的三疣梭子蟹养殖业发展迅速，已形成规模，但同时带来了种质、资源、环境及病害等诸多问题。由于对其遗传背景的了解较少，特别是其育种遗传基础理论的匮乏，无法制定或采取有效的措施来解决三疣梭子蟹养殖种质退化、抗逆性差等问题，严重制约了三疣梭子蟹养殖业的健康发展。中国科学院海洋研究所崔朝霞研究员主持的“三疣梭子蟹育种的遗传学基础”项目立足学科发展前沿，以我国重要经济蟹类三疣梭子蟹为研究对象，系统开展遗传多样性基础以及重要经济性状功能基因的研究，为遗传育种以及分子标记辅助选育奠定了基础，为推动我国蟹类养殖业的健康可持续发展提供了理论指导。
一、主要研究内容
1．筛选三疣梭子蟹微卫星标记并结合线粒体序列信息成功建成三疣梭子蟹多元高通量分子标记系统，用于三疣梭子蟹育种过程中的个体追踪和家系鉴定。
多元高通量遗传标记系统为线粒体序列信息系统和微卫星分子标记系统，其中微卫星分子标记系统为由7个SSR标记的系统1和6个SSR标记的系统2组成；运用线粒体的三对引物扩增COI，16S和控制区（CR）的序列的信息作为分子标记，将混养家系中同一母本和不同母本所产的后代根据遗传结构和遗传多样性分开，再运用微卫星分子标记，将已区分母本的后代根据遗传距离和遗传多样性进行父本的区分（图1），从而完成三疣梭子蟹遗传育种过程中的系谱认证并确认近交系数。
2．揭示三疣梭子蟹遗传多样性，系统研究其育种基础群体遗传结构和差异，构建三疣梭子蟹抗病品系，为野生种质资源的合理有效利用提供重要依据。
运用微卫星标记技术评估三疣梭子蟹5个育种基础群的遗传结构和遗传多样性；运用线粒体控制区序列信息评估三疣梭子蟹8个育种基础群的遗传结构和遗传多样性。根据遗传分析结果，构建了三疣梭子蟹抗病品系候选群体。
3．构建高质量的三疣梭子蟹血细胞和眼柄cDNA文库，为深入了解和丰富三疣梭子蟹遗传信息奠定基础，对三疣梭子蟹育种的分子遗传学研究具有重要推动作用。
项目构建了三疣梭子蟹血细胞和眼柄两种组织的cDNA 文库。从血细胞文库中随机测序获得4452条高质量的EST序列（GenBank注册号GT555584-GT560035），经拼接得到1066条Unigenes，包括461条Contigs和605条Singletons；从眼柄文库中随机测序获得4606条高质量的EST序列（GT560036-GT564641），可拼接为510条Unigenes，包括301条Contigs和209条Singletons。通过BLAST比对发现，血细胞文库中660条Unigenes、眼柄文库中365条Unigenes与GenBank数据库中的基因有较高同源性，血细胞文库中38.09%（406条Unigenes）和眼柄文库中28.43%（510条Unigenes）是未知基因或者说是公用数据库中没有的新基因。
4．成功获得大量三疣梭子蟹免疫相关基因
通过序列相似性比对和人工查找发现，血细胞cDNA文库中64条Unigenes、眼柄cDNA文库中35条Unigenes与免疫相关。这些基因可分为6类，分别是抗菌肽、氧化还原蛋白、黑化反应相关蛋白、分子伴侣蛋白、凝集因子和其它类别。
除了上述基因，在三疣梭子蟹中还发现了多种免疫相关基因，如分子伴侣、凝集因子和一些其它免疫分子。这些免疫基因的获得为进一步克隆和研究三疣梭子蟹功能基因奠定基础，将有助于深入理解蟹类先天免疫防御机制。
5．免疫相关基因的多种蛋白亚型分析
在三疣梭子蟹中发现了ALF的7种亚型（图2），PtALF1-3由于氨基酸序列相似性极高，推测很可能是由同一个基因组位点编码。序列比对和系统发育分析显示PtALF4-7与PtALF1-3明显不同。这些都提示PtALF1-7很可能是5个基因组位点编码。
在三疣梭子蟹中发现Crustin的3种亚型，均属于I型Crustin,三疣梭子蟹的PtCrustin1-3氨基酸序列相似性较低，提示它们很可能是来自不同的基因，由不同基因组位点编码。
在三疣梭子蟹中发现Trx的2种亚型，系统发育分析再次确认PtTrx1和PtTrx2分别属于Trx-1和Trx-2。
在三疣梭子蟹中发现16条酚氧化酶系统相关的Unigenes，包括丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶同源物、丝氨酸蛋白酶抑制剂等。
丝氨酸蛋白酶（SP）拥有催化三联体His、Asp和Ser组成的典型保守催化结构域（Tryp_SPc domain），是proPO系统中重要的调控蛋白。在三疣梭子蟹中发现5种带Clip结构域的丝氨酸蛋白酶（PtcSP1-5）和一种不含Clip结构域的丝氨酸蛋白酶。
丝氨酸蛋白酶抑制剂是对丝氨酸蛋白酶有抑制活性的一类蛋白质。在三疣梭子蟹中发现4种带有典型kazal结构域的kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂亚型。PtKPI1与PtKPI2-4氨基酸序列相似性较低，提示它们可能是由不同基因编码。PtKPI2-4之间序列相似性较高，它们很可能是由碱基多态性形成的。
6．发现并克隆了二十多个参与蟹类生长、免疫抗逆相关的功能基因cDNA全长序列，初步阐明这些基因的功能，为深入研究蟹类生长抗病性状的分子机制奠定重要基础。
首次系统开展了三疣梭子蟹酚氧化酶系统组成和功能的研究；开展了三疣梭子蟹抗菌肽包括抗脂多糖因子和Crustin研究。
二、主要创新点
1．首次将线粒体标记和细胞核标记结合建立多元高通道分子标记系统并用于三疣梭子蟹育种过程中的个体追踪和家系鉴定等，该技术解决遗传育种过程中虾蟹类等具有蜕皮特点的物种的标记问题，确保继代选育时的科学性，是实现可持续育种的重要保障。
2．运用微卫星标记和线粒体控制区序列信息评估三疣梭子蟹育种基础群的遗传多样性，该研究结果为种质资源的合理有效利用提供了重要依据，提示在建立育种基础群时应充分考虑当地的遗传资源并科学使用杂交技术。
3．构建三疣梭子蟹主要免疫组织血细胞和主要神经内分泌组织眼柄cDNA文库，获得9058条EST序列，对深入研究三疣梭子蟹遗传分子基础发挥了重要推动作用。
4．首次开展了三疣梭子蟹酚氧化酶系统的研究，发现多种酚氧化酶原激活系统相关的因子，并对该系统的功能进行了详细研究。
5．首次在三疣梭子蟹开展了基因不同亚型的研究，这可能是免疫因子适应性进化的分子基础。发现三疣梭子蟹抗脂多糖因子（ALF）的7种亚型和丝氨酸蛋白酶（SP）的6种亚型，这是到目前为止发现的种类最多的ALF和SP亚型；首次在甲壳动物中发现具有线粒体定位信号的Ⅱ型三疣梭子蟹硫氧还蛋白基因（PtTrx2），并分析报道PtTrx1和PtTrx2的基因组结构。
6．体外重组表达抗脂多糖因子、Crustin、丝氨酸蛋白酶及其抑制剂等重要功能基因，为蟹类功能基因资源的开发利用奠定了基础。
7．首次在三疣梭子蟹中开展热休克蛋白70、精氨酸激酶、抗脂多糖因子和Crustin等功能基因的SNP位点筛查，为生长和抗病品系培育提供理论指导。
8．运用以上遗传信息，获得授权发明专利“一种三疣梭子蟹快速生长品系的构建方法”、“一种三疣梭子蟹抗病品系的构建方法”和“一种三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统及遗传分析方法”。
三、社会经济效益
项目从我国三疣梭子蟹养殖业发展的根本需要和长远利益出发，针对目前三疣梭子蟹养殖最突出的种质退化、抗逆性差特别是病害问题，通过查清三疣梭子蟹种质遗传资源分布、主要经济性状的分子遗传学基础等，为种质资源的合理有效利用提供了重要依据，为遏制蟹病害的发生和流行提供新途径和新思路，推动了我国蟹类分子设计育种的发展。
目前我国三疣梭子蟹养殖广泛分布于沿海各省份，利用项目技术原理和发明专利培育的三疣梭子蟹抗病品系示范推广后，直接影响浙江和山东的梭子蟹养殖产业，仅2011年这两个省份的养殖面积就达二十多万亩，产量超过全国养殖产量的60%，产值近50亿元人民币，社会、经济效益巨大。项目合理利用自然资源，利用现代先进育种技术，充分挖掘生物自身生长潜力，提高单位收益率，促进了产业进入良性循环，改善了农业生态环境，为实现农业的可持续发展奠定了坚实基础。
专家简介
崔朝霞，海洋生物专业，博士，香港中
主持课题来源包括企业横向课题、国家自然科学基金、国家863计划、国家科技支撑计划、国家农业科技成果转化项目、瑞典国际基金以及国际计划UNDP/GEF Project、中国科学院奖励基金等。近年共发表接收论文六十余篇，2009年以来共发表第一作者和通讯作者SCI论文32篇，累计影响因子总和超过80；以第一发明人获得授权发明专利4项。“我国重要经济蟹类免疫与遗传学基础研究”荣获2009年度国家海洋创新成果奖二等奖、“中华绒螯蟹育苗和养殖关键技术开发与应用”荣获2010年度国家科学技术进步奖二等奖、“三疣梭子蟹育种的遗传学基础”荣获2012年度国家海洋创新成果奖二等奖、“三疣梭子蟹抗病选育的分子遗传学基础研究”荣获2012年度青岛市自然科学二等奖。
